“九一八”事变后，曾任*哈尔滨市市委书记、兼满洲省委军委代理书记，中国工农红军第32军南满游击队政治委员，东北人民革命军第1军第1独立师师长兼政治委员，东北人民革命军第1军军长兼政治委员和抗联第1军军长兼政治委员，东北抗联第1路军总司令兼政治委员。
他认真执行党的抗日武装统一战线政策，团结联合东北抗日义勇军共同对敌作战。注重部队全面建设，加强党的领导，深入开展政治思想工作，培育英勇善战精神，适时整顿部队，严格组织纪律，使抗日联军第一路军成为一支人民抗日武装，勇猛杀敌的劲旅。最早创建磐石红石砬子抗日游击根据地，尔后扩大到南满、东南满20余县，被日伪称为“第一癌肿地带”。
1940年1月，为解决部队给养问题，命部队主力北上，自己带领一支小部队东进。到了最后，他身边仅有7名战士，4名负伤。于是杨靖宇下令4人转移。后来，他派了剩下的两名战士去村落找些吃的，下山后，两名战士被日伪军杀死。杨靖宇明白了一切。2月22日，杨靖宇在一间雪地中的小破屋里度过了人生的最后一夜。2月23日，他孤身一人在吉林蒙江县(今靖宇县)保安村前三道崴子遇到四个中国人，杨靖宇恪守党的铁的纪律，不拿群众的一针一线，于是给了钱，让其中一人帮他买些食物和棉鞋。那个人回大屯泄密给日伪*;关东军讨伐队包围了杨靖宇，并紧急召集由抗联叛徒组成的伪满特工队参战;经过数小时激战，杨靖宇被叛徒机枪点射命中要害，壮烈殉国。终年三十五岁。
杨靖宇将军牺牲后，凶残的日军割下他的头颅，解剖了他的遗体，发现胃里竟一粒粮食也没有，满是树皮、草根和棉絮。残暴的日军割下他的头颅，送伪都长春请赏。杨靖宇率领第1路军在东南满的抗日战场上纵横驰骋英勇杀敌的光辉业绩，他“满腹棉絮枯草，战斗到最后一人，以身报国”的革命精神，将彪炳史册，永励后人。
